PBCV DNA Ligase，亦称为SplintR连接酶、PBCV-1 DNA Ligase或Chorella病毒DNA连接酶，是一种ATP依赖的DNA连接酶，能够高效催化与一条互补的RNA单链配对的两条相邻DNA单链的连接反应。这两条相邻的DNA链中，提供3'羟基的被称之为受体DNA链(Acceptor DNA)，提供5'磷酸的被称之为供体DNA链(Donor DNA)，在这个连接过程中需要一条互补的RNA链对两条DNA单链起“夹板”或“支架”的作用（图1）。

PBCV DNA Ligase的连接活性远优于传统T4 DNA 连接酶，并对以 RNA 为夹板的 DNA 底物表现极高的出亲和力（表观 Km = 1 nM，Km值越小表示亲和力越强），从而能够对复杂混合物中独特的 RNA 种类进行亚纳摩尔级检测。因此，该酶非常适合应用于高灵敏度RNA检测，包括各种SNP的miRNA、mRNA和非编码RNA的定性或定量检测，以及用于二代测序和分子诊断。接下来，小编给大家介绍下PBCV DNA Ligase的神奇应用吧！

PBCV DNA Ligase应用解析

 01

原位测序

空间转录组学能够绘制出组织中特定转录本的位置，识别特定基因的表达位置，从而可以从分子层面更全面地研究组织，目前主要的空间转录组技术包括：

如表所示，原位测序是一种在细胞或组织中直接进行mRNA序列分析的空间转录组技术。该技术通过特制探针与目标mRNA杂交，利用滚环扩增（RCA）在特定位置生成信号，接着用荧光染料标记来识别具体序列，已实现保留基因表达的空间信息的目的。今天，小编主要以Mip-seq为例，介绍下PBCV DNA Ligase在原位测序中的应用。Mip-Seq技术通过PBCV DNA Ligase连接构建RCA模板，接着RCA扩增以放大信号，并结合多轮测序以实现高通量检测，能够以亚细胞分辨率有效解析DNA、RNA、蛋白质和小分子等多种生物分子，可用于检测肿瘤基因突变和亲本基因的等位基因特异性表达，从而实现精确的肿瘤诊断。

MiP-Seq技术路线如下：

 01 

挂锁探针杂交

使用特定的挂锁探针（padlock probes）与目标RNA相结合，这些探针带有RCA启动子引物探针，用于目标依赖的RCA。

02 

原位滚环扩增（RCA）

使用PBCV DNA Ligase（图示SplintR连接酶）将挂锁探针连接成环状，形成RCA模板，在Phi29聚合酶的作用下进行原位滚环扩增。

03 

数据分析

对原位滚动扩增产物（RCP）进行多轮测序，并通过连接和信号解码来解读数据。

02

高灵敏核酸检测

分子检测，特别是核酸检测，因其快速、灵敏和精准而受到青睐，但无论是标准qPCR技术还是等温扩增技术都需要一定的实验设备，限制了病原体检测的普及性应用。为此，张锋名下的诊断公司Sherlock Bioscience开发了一款无需仪器、可在环境温度下实现精确且多重核酸检测的INSPECTR核酸检测技术[2]，其应用不仅局限于传染病诊断，还扩展到检测抗微生物肽、单核苷酸多态性等方面。

INSPECTR核酸检测技术原理如下：

 01 

连接单链DNA

单链DNA探针经过设计，在特定靶向RNA上具备同源性，当RNA“扣夹”三元分子结构时，PBCV DNA Ligase（图示SplintR ligase）进行单链DNA的连接。

02 

扩增双链线性产物

DNA聚合酶合成连接后的ssDNA探针的互补链，从而产生了编码报告蛋白的双链DNA（dsDNA）表达盒。

03 

产生报告产物

向表达盒添加含有核糖体、T7 RNA聚合酶、转录因子、氨基酸、核苷酸及其他辅因子的无细胞表达（CFE）系统后，产生可通过视觉或电子装置检测到的报告蛋白。

除了上述应用，PBCV DNA Ligase也被应用于EXTRA-CRISPR技术[3]（Cas12介导的高灵敏度miRNA检测）以及SELECT技术[4]（基于单碱基延伸和连接的qPCR扩增方法）等。在EXTRA-CRISPR技术中，该酶通过连接形成RCA模板，为随后的RCA扩增和信号增强提供了基础，显著提升了Cas12系统对miRNA的检测敏感性。而SELECT方法则是借助m6A修饰可阻止PBCV DNA Ligase连接两个寡核苷酸的特性，在经过几轮m6A选择后，含m6A的RNA模板产生的连接产物显著少于未修饰的RNA模板，接着通过qPCR可进行精确定量分析。这些应用实例充分展示了PBCV DNA Ligase在原位测序、RNA检测等方面的广阔应用前景。

翌圣PBCV DNA Ligase

翌圣团队潜心研发，通过翌圣镁孚泰生物ZymeEditor™酶进化平台（了解更多），成功推出PBCV DNA Ligase（Cat#14962）。翌圣PBCV DNA Ligase来源于Chorella virus，其蛋白纯度＞95%，无核酸外切酶、内切酶、RNase、磷酸酶残留，特别适用于原位测序、高灵敏核酸检测等应用场景。

部分数据展示

无核酸外切酶、内切酶、RNase、磷酸酶残留

将3个批次的翌圣PBCV DNA Ligase (Cat#14962ES)与底物DNA在37℃孵育4 h（125 U 投入量），以及与底物RNA在37℃孵育16 h（25 U 投入量）。琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，翌圣PBCV DNA Ligase无核酸外切酶、切口酶、RNase残留。同时，利用磷酸酶检测盒对3个批次的PBCV DNA Ligase进行检测，4 h反应后，酶活(µmol/min)数据显示翌圣PBCV DNA Ligase磷酸酶残留极低（<0.0001）。

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